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Clonación, sobreexpresión y determinación de la especificidad iónica de Pma1, una posible Na+/K+ ATPasa de Mycobacterium smegmatis

Ayala Torres, Carlos Mario (2014) Clonación, sobreexpresión y determinación de la especificidad iónica de Pma1, una posible Na+/K+ ATPasa de Mycobacterium smegmatis. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia.

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Resumen

La tuberculosis (TB) es uno de los retos más importantes para la salud pública en el mundo. Actualmente existe una prevalencia de 2 billones de personas infectadas con Mycobacterium tuberculosis, lo que representa el 30% de la población mundial; en este contexto la TB junto con el VIH/SIDA (Virus de Inmunodeficiencia Humana/Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) son las enfermedades que causan el mayor número de muertes ocasionadas por agentes infecciosos en el mundo, por lo que el descubrimiento de nuevos blancos terapéuticos es una prioridad en la investigación para el control de la TB. En la actualidad, las proteínas de membrana plasmática han ganado relevancia como blancos terapéuticos para el control de patógenos intracelulares, en especial, las proteínas encargadas del transporte iónico como los transportadores ABC, las ATPasas tipo P y los sistemas antiporter ion/H+. Específicamente, las ATPasas tipo P juegan un papel esencial en múltiples procesos biológicos de las células, entre ellos, la captura de nutrientes del medio extracelular, la desintoxicación con metales, la regulación del volumen celular, además son consideradas como factores de virulencia. De hecho, la homeóstasis iónica es relevante en la fisiología de la interacción hospedero-patógeno; ya que ambos han desarrollado mecanismos sofisticados para el transporte de iones hacia el interior o el exterior celular dependiendo de sus necesidades [1]. Se conoce que una vez fagocitada y durante la maduración del fagosoma, M. tuberculosis se enfrenta a variaciones considerables en la concentración de iones como Ca2+, K+ y Cl-, lo que también se ha relacionado con la acidificación del fagosoma [1]. Nuestro grupo de investigación se ha dedicado en los últimos años a indagar el potencial de las ATPasas tipo P o bombas de transporte catiónico (Ca2+, Na+, K+, Na+/K+), como dianas potenciales para el diseño de compuestos antimicobacterianos. Recientemente se ha considerado que Pma1, una posible ATPasa tipo P relacionada con el transporte de metales alcalinos/alcalinotérreos de Mycobacterium smegmatis, podría ser la contraparte del transportador CtpF de M. tuberculosis, este último de relevancia en los procesos de infección y condiciones de estrés del bacilo tuberculoso. Las características y el rol biológico de Pma1 son completamente desconocidas. En el presente trabajo, se realizó un estudio in silico del gen pma1 para determinar su posible especificidad iónica en M. smegmatis. Este análisis bioinformático determinó que esta posible ATPasa tipo P pertenece a un grupo de enzimas que transportan metales alcalinos/alcalinotérreos con mayor probabilidad de transportar Calcio y/ó Sodio/Potasio. Para confirmar esta predicción, el gen pma1 se clonó en el sistema pBAD-A-Myc-His y en el vector lanzadera pMV261 para determinar la influencia de la sobreexpresión del transportador en la viabilidad de células de E. coli y M. smegmatis respectivamente, bajo concentraciones tóxicas de diferentes metales alcalinos/alcalinotérreos. Se observó que Pma1 le proporciona a las células mayor tolerancia a concentraciones tóxicas de Na+, K+ y Na+/K+ en cultivo, siendo mayor el efecto para las micobacterias en comparación con E. coli. Por otra parte, mediante experimentos de PCR en tiempo real se determinaron cambios en el perfil transcripcional del gen pma1 en M. smegmatis cultivado en concentraciones sub-letales de metales alcalinos/alcalinotérreos (1100 mM Na+, 1100 mM K+, 1100 mM Na+/K+ y 400 mM Ca2+). Se observó que la estimulación iónica activa de forma decreciente la transcripción de pma1 en el siguiente orden: K+ > Ca2+ > Na+ > Na+/K+. Finalmente, se realizaron ensayos de actividad ATPasa en vesículas de membrana plasmática de M. smegmatis y E. coli expresando la proteína Pma1 de M. smegmatis, donde se encontró que para M. smegmatis el transporte de iones en vesículas de membranas es activado de forma creciente de la siguiente manera: Na+ < Ca2+ < K+ < Na+/K+, mientras que para E. coli se encontró así: Ca2+ < Na+/K+ < K+ < Na+. Finalmente, se encontró que Pma1 presenta mayor afinidad por iones Ca2+ y mayor velocidad de transporte para iones Na+/K+. Los resultados obtenidos se podrían extrapolar al posible comportamiento que pueda tener su homólogo, CtpF, en el bacilo tuberculoso., Abstract. Tuberculosis (TB) is one of the most important public health challenges in the world. Currently there is a prevalence of 2 billion people infected with Mycobacterium tuberculosis, which represents 30% of the world population; in this context the TB along with HIV/AIDS (Human Immunodeficiency Virus/Acquired Immunodeficiency Syndrome) are diseases that cause most deaths caused by infectious agents in the world, so the discovery of new therapeutic targets is research a priority for TB control. Currently, plasma membrane proteins have gained prominence as therapeutic targets for controlling intracellular pathogens, in particular those responsible for ion transport proteins as ABC transporters, P-type ATPases and ion/H+ antiporter systems. Specifically, P-type ATPases play an essential role in many biological processes of cells, including nutrient capture of the extracellular medium, metal detoxification and cell volume regulation. These are considered virulence factors. In fact, ionic homeostasis is important in the physiology of the host-pathogen interaction; as both have developed sophisticated mechanisms for the transport of ions into or outside the cell depending on their needs [1]. It is known that once phagocytized and phagosome maturation during M. tuberculosis faces considerable variations in the concentration of Ca2+, K+ and Cl- ions, which is also linked to the acidification of the phagosome [1]. Our research group has been dedicated in recent years to investigate the potential of P-type ATPases or pumps cation transport (Ca2+, Na+, K+, Na+/K+) as potential targets for the design of antimycobacterial compounds. Recently it has been considered that Pma1, a possible P-type ATPase related to the transport of alkali/alkaline earth metals in Mycobacterium smegmatis could be the counterpart of CtpF in M. tuberculosis, the latter of relevance in the process of infection and stress conditions of the tubercle bacillus. The characteristics and the biological role of Pma1 are completely unknown. In this work, an in silico study of the pma1 gene was performed to determine possible ionic specificity in M. smegmatis. The bioinformatic analysis showed that the P-type ATPase might belong to a group of enzymes that transport alkali/alkaline earth metal are more likely to transport Calcium and/or Sodium/Potassium. To confirm this prediction, the pma1 gene was cloned into the pBADA- Myc-His system and the shuttle vector pMV261 to determine the effect of overexpression of the transporter in the viability of cells of E. coli and M. smegmatis respectively, using toxic concentrations of different alkali/alkaline earth metals. It was observed that Pma1 provides cells increased tolerance to toxic concentrations of Na+, K+ and Na+/K+ in culture, the effect being greater in mycobacteria compared to E. coli. Moreover, through Real-time PCR experiments changes were determined in the transcriptional profile of pma1 gene in M. smegmatis grown on sublethal concentrations alkali/alkaline earth metal (1100 mM Na+, 1100 mM K+, 1100 mM Na+/K+ and 400 mM Ca2+). It was observed that the active form ionic stimulation of transcription of pma1 decreasing in the following order: K+ > Ca2+ > Na+ > Na+/K+. Finally, ATPase activity assays were performed on plasma membrane vesicles of M. smegmatis and E. coli expressing M. smegmatis protein Pma1, where it was found that M. smegmatis for ion transport in membrane vesicles is activated and increased as follows: Na+ < Ca2+ < K+ < Na+/K+, whereas E. coli was found as follows: Ca2+ < Na+/K+ < K+ < Na+. Finally it was decided that the best conditions for the activation of Pma1 plasma membrane, are given using 10 mM Na+, 100 mM K+, 10/40 mM Na+/K+ and 30 μM Ca2+, BRIJ-58 (0,01%- 0,05%), 8 μg of recombinant membrane protein, 30 minutes of reaction, pH 7,4, at 37°C. Kinetic parameters Km and Vmax were also determined for Na+/K+ (54,98 μM and 17,18 U/mg of protein, respectively) and Ca2+ (0,4643 μM and 8,503 U/mg of protein, respectively), they followed a Michaelis-Menten kinetics. The results could be extrapolated to the possible behavior that may have its counterpart, CtpF in the tubercle bacillus.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Soto Ospina, Carlos Yesid
Información adicional:Magister en Ciencias-Bioquímica. Línea de Investigación: Interacción Hospedero-Patógeno
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis mc2155, ATPasas tipo P, Pma1, Metales alcalinos/alcalinotérreos, P-type ATPases, Alkali/alkaline earth metals
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 54 Química y ciencias afines / Chemistry
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:48361
Enviado por : Carlos Mario Ayala Torrres
Enviado el día :11 May 2015 08:42
Ultima modificación:11 May 2015 08:42
Ultima modificación:11 May 2015 08:42
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