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Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

Quitian Cruz, Laudy Viviana (2017) Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia- Sede Bogotá.

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Resumen

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB). Actualmente, Mtb es el mayor causante de muertes por un agente infeccioso en el mundo. Las principales estrategias para el control de la TB incluyen la quimioterapia, el diagnóstico temprano y la vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Sin embargo, el surgimiento de cepas multifármaco resistentes (MDR) y extremadamente fármaco resistentes (XDR) han dificultado el control de la TB. Por lo tanto, se hace prioritario identificar nuevos blancos terapéuticos para así poder desarrollar nuevas alternativas de control. Una de las estrategias que utilizan los macrófagos cuando han fagocitado a Mtb, es aumentar la concentración de metales como hierro, cobre, zinc, potasio, calcio y manganeso, por lo que la micobacteria requiere de sistemas que permitan el eflujo y la detoxificación de metales, para mantener la homeostasis iónica. Específicamente, Mtb codifica 28 genes encargados del transporte de iones metálicos, de los que 12 son genes que codifican ATPasas tipo P que se expresan diferencialmente durante la infección, una amplia cantidad, respecto a otros patógenos intracelulares. Las ATPasas tipo P son enzimas que catalizan el transporte de cationes metálicos en contra del gradiente de concentración, a partir de la hidrólisis del ATP. Su expresión es fundamental para la viabilidad celular debido a su participación en procesos de detoxificación, metalación de otras proteínas y en respuesta a estrés oxidativo. Su localización transmembranal, las hace un blanco terapéutico más accesible a los fármacos, respecto a blancos citoplasmáticos. Se ha reportado que CtpG, una ATPasa tipo P1B, se induce durante la infección de Mtb en macrófagos humanos, en condiciones de hipoxia, inanición y en presencia de sustancias tóxicas como altas concentraciones de metales pesados (Cu2+-500 µM y Zn2+-500 µM) que afectan la viabilidad de Mtb. Adicionalmente CmtR, el regulador transcripcional de ctpG, es sensado por Cd2+ en Mtb H37Rv, lo que sugiere que CtpG podría ser una bomba encargada del eflujo de este metal tóxico. Por todo lo anterior, CtpG podría ser un blanco terapéutico interesante, por lo que se hace importante conocer muchas de sus características funcionales. En el presente trabajo se propuso determinar algunas características de CtpG como la especificidad iónica en membrana de micobacterias, y el comportamiento transcripcional en presencia de concentraciones subletales de metales pesados posiblemente transportados por esta enzima. Además, se desarrollaron herramientas para la producción de anticuerpos policlonales contra CtpG. La expresión de CtpG recombinante se optimizó usando el sistema pBAD A Myc His, en E. coli LMG194. La proteína se expresó en la fracción soluble utilizando 0.3% de L- arabinosa y 8 horas de inducción a 20°C. Así mismo la mayor parte de la proteína se detectó en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión en todas las condiciones de cultivo analizadas. Se encontró que los iones Cu2+, Co2+, Cd2+ y Pb2+ inducen la actividad enzimática mediada por CtpG en la membrana plasmática de micobacteria, con valores de 6.25 ± 1.429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 y 6.2099 ± 1.745 U/mg de proteína, respectivamente. Para hacer un acercamiento a la especificidad iónica, se realizaron ensayos de tolerancia a concentraciones tóxicas de metales pesados en M. smegmatis mc2155 sobreexpresando CtpG. Se encontró que CtpG genera tolerancia a Cd2+ y Cu2+ en células completas de micobacteria. De acuerdo a estos resultados, se determinaron las constantes cinéticas de la proteína recombinante utilizando Cd2+ (Vmáx: 0,856 ± 0,01y Km: 0,108 ± 0,007) y Cu2+ (Vmáx: 1,051 ± 0,155 y Km: 0,981±0,422) como sustratos. Esto permitió apreciar que los iones Cd2+, podrían ser más eficientemente transportados por CtpG., Abstract. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the etiologic agent of tuberculosis (TB). Mtb is currently the largest cause of death by an infectious agent in the world. Key strategies for TB control include chemotherapy, early diagnosis and vaccination with the Bacillus Calmette-Guérin (BCG). However, the emergence of resistant multidrug resistant (MDR) and extremely drug resistant (XDR) strains has undoubtedly made TB control difficult. Therefore, it is a priority to identify new therapeutic targets in order to develop new control alternatives. One of the strategies used by macrophages when they have phagocytosed Mtb is to increase the concentration of metals such as iron, copper, zinc, potassium, calcium and manganese, so the mycobacteria requires systems that allow efflux and detoxification of metals, to maintain ionic homeostasis. Specifically, Mtb encodes 28 genes responsible for the transport of metal ions, of which 12 are P-type ATPases expressing differentially during infection, a large amount, relative to other intracellular pathogens. The P type ATPases are enzymes that catalyze the transport of metallic cations generally against the concentration gradient, from the hydrolysis of ATP. Its expression is fundamental for cell viability due to its participation in processes of detoxification, metalation of other proteins and in response to oxidative stress. Their transmembrane location makes them a therapeutic target more accessible to drugs than cytoplasmic targets. CtpG, a P1B-type ATPase, has been reported to be induced during Mtb infection in human macrophages under conditions of hypoxia, starvation and in the presence of toxic substances such as high concentrations of heavy metals (Cu2+ -500 μM and Zn2+ -500 μM) that affect the viability of Mtb. In addition CmtR, the ctpG transcriptional regulator, is Cd2+ sensitive in Mtb H37Rv, suggesting that CtpG could be a pump responsible for the efflux of this toxic metal. For all of the above, CtpG could be an interesting therapeutic target, so it becomes important to know many of its functional characteristics. In the present work it was proposed to determine some characteristics of CtpG as the membrane ionic specificity of mycobacteria, and the transcriptional behavior in the presence of sublethal concentrations of heavy metals possibly carried by this enzyme. In addition, tools were developed for the production of polyclonal antibodies against CtpG. Expression of recombinant CtpG was optimized using the pBAD A Myc His system in E. coli LMG194. The protein was expressed in the soluble fraction using 0.3% of L-arabinose and 8 hours of induction at 20 ° C. Likewise, most of the protein was detected in the insoluble fraction as inclusion bodies in all culture conditions analyzed. It was found that the Cu2+, Co2+, Cd2+ and Pb2+ ions induce the CtpG-mediated enzyme activity in the mycobacterial plasma membrane, with values of 6.25 ± 1429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 and 6.2099 ± 1.745 U / mg protein, respectively. To approach the ionic specificity, tolerance tests were performed at toxic concentrations of heavy metals on M. smegmatis mc2 155 overexpressing CtpG. It was found that CtpG generates tolerance to Cd2+ and Cu2+ in whole mycobacterial cells. According to these results, the kinetic constants of the recombinant protein were determined using Cd2+ (Vmax: 0.856 ± 0.01 and Km: 0.108 ± 0.007) and Cu2+ (Vmax: 1.051 ± 0.155 and Km: 0.981 ± 0.422) as substrates. This allowed to appreciate that the Cd2+ ions, could be more efficiently transported by CtpG.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Soto Ospina, Carlos Yesid
Información adicional:Magíster en Ciencias- Bioquímica. Línea de Investigación: Interacción Hospedero-Patógeno.
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, Transporte de iones metálicos, ATPasas tipo P, CtpG, Péptidos antigénicos, Mycobacterium tuberculosis, Metal ion transport, P-type ATPases, Antigenic peptides
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 54 Química y ciencias afines / Chemistry
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine & health
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:61432
Enviado por : Laudy Viviana Quitian Cruz
Enviado el día :17 Enero 2018 03:26
Ultima modificación:17 Enero 2018 03:26
Ultima modificación:17 Enero 2018 03:26
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