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Análisis de la infección del rotavirus WT1-5 en células tumorales sometidas a estrés oxidativo

Guerrero Sandoval, Marvi Angelica (2018) Análisis de la infección del rotavirus WT1-5 en células tumorales sometidas a estrés oxidativo. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá.

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Resumen

Titulo Análisis de la infección del rotavirus WT1-5 en células tumorales sometidas a estrés oxidativo. Introducción El estrés oxidativo es una situación bioquímica que se caracteriza por el desequilibrio entre los radicales libres, principalmente las especies reactivas de oxígeno (ROS), especies reactivas de nitrógeno, y los mecanismos de defensa antioxidantes. ROS ejercen un papel dual en los sistemas biológicos y en el desarrollo de enfermedades. Antecedentes de Laboratorio En trabajos previos hemos reportado que la infección por rotavirus en líneas celulares y en condiciones in vivo en animales y pacientes humanos es inhibida por la terapia anti-oxidante. Específicamente, que la infección de rotavirus aumenta NFkB, y al inhibirla con reactivos se disminuye la infección de rotavirus. Igualmente, al adicionar agonistas de PPARgamma (factor de transcripción inhibidor de NFkB) se disminuye la infección de rotavirus. Pregunta de investigación En este trabajo se pretende conocer si el rotavirus se beneficia del estrés oxidativo y probablemente lo induce durante el proceso infeccioso en células tumorales. Métodos Para esto, se llevaron a cabo ensayos sometiendo células tumorales MCF-7 y REH en condiciones de estrés oxidativo, utilizando fármacos inductores de especies reactivas de oxigeno (ROS) (cisplatino 20 µM, doxorrubicina 50 nM, peróxido de hidrogeno 12,5 µM, ácido valpróico 10 mM, DHA 50 µM, losartán 100 µM, melatonina 100 nM, metronidazol 1500 µM y nitrofurantoina 200 nM), teniendo en cuenta la citotoxicidad evaluada mediante la técnica de MTT y Azul deTripan. Las células fueron infectadas con el rotavirus, posteriormente se adicionó el fármaco y las células se cosecharon a las 12 horas post infección (h.p.i.). La infección se evaluó mediante técnicas de inmunocitoquímica, ELISA de captura e Inmunofluorescencia. Igualmente se analizó marcadores de muerte celular mediante Inmunofluorescencia y Citometría de flujo; la permeabilidad de la membrana mitocondrial y citoplasmática mediante Resazurina y 7AAD. La degradación del DNA se evaluó con la técnica de TUNEL. Resultados Los resultados de este trabajo indican que la infección viral por el rotavirus oncolítico WT1-5 genera ROS y estos se aumentan cuando se aplican los fármacos. El incremento de ROS se correlaciona con un aumento en la producción de virus a partir de las 4 - 6 h.p.i., hasta las 12 h.p.i., respecto a cuándo se infecta y no se aplican fármacos. Igualmente, se altera la permeabilidad de la membrana celular y mitocondrial, ocasiona daño en el DNA y aumento de marcadores de muerte celular. Adicionalmente, el fármaco losartán altera la expresión de la matriz extracelular y facilita la infección en líneas tumorales con abundante matriz como en células de melanoma humano A375 y SK-MEL. Conclusión La infección viral por rotavirus oncolítico, se encuentra asociado a procesos oxidoreductores. Los resultados originales de este trabajo implican que inducir ROS en células tumorales infectadas por rotavirus aumenta el número de viriones, el porcentaje de células infectadas y la muerte celular por rotavirus oncolítico. Esto no se conocía ni está reportado para rotavirus en células tumorales. Este conocimiento original contribuye a nivel internacional, e indica que el rotavirus oncolítico se puede utilizar en combinación con la radioterapia o la quimioterapia, ya que los dos tratamientos convencionales son inductores de estrés oxidativo intracelular., Absatract: Title Analysis of WT1-5 rotavirus infection in tumor cells subjected to oxidative stress. Introduction Oxidative stress is a biochemical situation that is characterized by the imbalance between free radicals, mainly reactive oxygen species (ROS), reactive nitrogen species, and antioxidant defense mechanisms. ROS exert a dual role in biological systems and in the development of diseases. Laboratory Background In previous studies we have reported that rotavirus infection in cell lines and in vivo conditions in animals and human patients is inhibited by anti-oxidant therapy. Specifically, rotavirus infection increases NFkB, and inhibiting it with reagents decreases rotavirus infection. Likewise, by adding PPARgamma agonists (NFkB inhibitory transcription factor), rotavirus infection is decreased. Research question In this work we try to know if the rotavirus benefits from oxidative stress and probably induces it during the infectious process in tumor cells. Methods For this, tests were carried out by submitting tumor cells MCF-7 and REH under conditions of oxidative stress, using drugs inducing reactive oxygen species (ROS) (20 μM cisplatin, 50 nM doxorubicin, 12.5 μM hydrogen peroxide, 10 mM valpróico acid, 50 μM DHA, 100 μM losartan, 100 nM melatonin, 1500 μM metronidazole and 200 nM nitrofurantoin), taking into account the cytotoxicity assessed by the MTT technique and Trypan Blue. The cells were infected with the rotavirus, later the drug was added and the cells were harvested at 12 hours post infection (h.p.i.). The infection was evaluated by immunocytochemistry, capture ELISA and immunofluorescence techniques. Likewise, markers of cell death were analyzed by means of immunofluorescence and flow cytometry; the permeability of the mitochondrial and cytoplasmic membrane through Resazurina and 7AAD. DNA degradation was evaluated with the TUNEL technique. Results The results of this work indicate that viral infection with WT1-5 oncolytic rotavirus generates ROS and these are increased when the drugs are applied. The increase in ROS correlates with an increase in virus production from 4 - 6 h.p.i., up to 12 h.p.i., compared to when it is infected and drugs are not applied. Likewise, the permeability of the cellular and mitochondrial membrane is altered, causing DNA damage and increased cell death markers. In addition, the drug losartan alters the expression of the extracellular matrix and facilitates infection in tumor lines with abundant matrix as in human melanoma cells A375 and SK-MEL. Conclusion Viral infection with oncolytic rotavirus is associated with oxidoreducing processes. The original results of this work imply that inducing ROS in tumor cells infected with rotavirus increases the number of virions, the percentage of infected cells and cell death by oncolytic rotavirus. This was not known or reported for rotavirus in tumor cells. This original knowledge contributes internationally, and indicates that oncolytic rotavirus can be used in combination with radiotherapy or chemotherapy, since the two conventional treatments are inducers of intracellular oxidative stress.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Guerrero Fonseca, Carlos Arturo
Información adicional:Magíster en Bioquímica. Línea de Investigación: Rotavirus Oncolítico.
Palabras clave:Estrés oxidativo, Rotavirus, Cáncer, Infección viral, Células tumorales, Tumor cells, Cancer, Viral infection, Oxidative stress
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine & health
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Medicina > Departamento de Ciencias Fisiológicas
Código ID:70187
Enviado por : Marvi Angelica Guerrero Sandoval
Enviado el día :03 Dec 2018 16:24
Ultima modificación:03 Dec 2018 16:24
Ultima modificación:03 Dec 2018 16:24
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