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Determinación de características funcionales de CtpF, una Ca2+ ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis

Rosales-Hernández, Cristian (2019) Determinación de características funcionales de CtpF, una Ca2+ ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia-Sede Bogotá.

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Resumen

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB), una enfermedad infecciosa que causó 1,3 millones de muertes en el año 2017 (de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, WHO), de las que 0,3 millones correspondieron a pacientes coinfectados con VIH. Diversos compuestos quimioterapéuticos y la vacuna BCG son utilizados para el tratamiento de esta enfermedad, pero el surgimiento de cepas multirresistentes y extra-resistentes a los medicamentos además de la eficacia variable de la vacuna han dificultado su control, haciendo a la TB una de las 9 causas de muerte más frecuentes a nivel mundial. La respuesta del sistema inmune a la infección con Mtb comprende su confinamiento en macrófagos al interior de los que el bacilo es sometido a distintas condiciones de estrés como el aumento en la concentración de iones metálicos, reducción de la tensión de oxígeno y la presencia de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno. De manera interesante, el comportamiento transcripcional de los 12 genes de ATPasas tipo P codificados en el genoma de Mtb se ve afectado por una o varias de estas condiciones. CtpF, el homologo micobacteriano de la SERCA Ca2+-ATPasa de eucariotas superiores, es la ATPasa que responde a un mayor número de condiciones de estrés, especialmente condiciones de hipoxia; además ctpF es uno de los genes regulados por DosR, regulador global en la adaptación del bacilo tuberculoso al ambiente anaeróbico del macrófago y la entrada al estado de latencia. A través de análisis bioinformáticos y estudios in vitro se ha logrado asociar la actividad ATPasa de CtpF con el transporte de calcio. La evidencia muestra que la hidrólisis de ATP es estimulada por el Ca2+ y, de manera indirecta, se ha observado que contribuye a la tolerar la intoxicación con el metal. No obstante, hasta el momento no ha sido posible verificar la especificidad iónica de CtpF, dado que los experimentos también permiten postular a Na+ y a K+, además de Ca2+, como posibles cationes transportados. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue comprobar la especificidad iónica de CtpF, a través del estudio de la acumulación de calcio en células completas y vesículas de membrana de M. smegmatis expresando CtpF de M. tuberculosis de forma heteróloga. Como vector de expresión se utilizó pMV261, un vector lanzadera de micobacterias basado en el promotor de choque térmico de Mycobacterium bovis Hsp60. También se analizó el comportamiento de la ATPasa Pma1, homólogo de CtpF en Mycobacterium smegmatis, con el fin de comparar su respuesta en los ensayos de acumulación y así inferir si sus funciones son equivalentes. Los resultados muestran que las células de M. smegmatis wt y de un mutante defectivo en el gen pma1, transformadas con recombinantes de CtpF y Pma1, acumulan menos calcio que las cepas silvestres o mutante transformadas con el vector pMV261, sugiriendo que las ATPasas están involucradas en el eflujo de este ion desde la cara citoplasmática de la membrana. La intoxicación con Na+ y Na+/K+ de estas células no muestra una acumulación significativa de estos iones en las cepas recombinantes, lo que da soporte a este hallazgo. La acumulación en vesículas de membrana confirmó la dirección del transporte, toda vez que esta ha sido mayor en las vesículas sobre expresando el transportador. Durante la preparación de las vesículas se favorece una configuración inside-out que expone los dominios citoplasmáticos al exterior de estas. Esta evidencia experimental corrobora que CtpF es una ATPasa calcio-dependiente que está involucrada en la homeostasis de calcio al transportarlo desde el interior hacia el exterior celular., Abstract: Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the etiologic agent of tuberculosis (TB), an infectious disease that caused 1,3 million deaths during 2016 among which 0.4 million were from patients coinfected with VIH. Different strategies that include chemotherapy and the BCG vaccine are currently employed to treat and limit the spread of the disease. Unfortunately, the evolution of multidrug resistant and extra resistant Mtb strains plus the wide variability of the vaccine’s efficiency and poor effectivity against pulmonary TB have affected its control, making it the ninth human death cause worldwide. Immune system’s response to the Mtb infection includes its engulfing by macrophages which in turn put it in an environment with severe stress conditions like a high load of heavy metal ions, a reduced oxygen tension and different ROS and NOS. Interestingly, the transcriptional behaviour of 12 putative ATPase genes coded in the bacillus genome is affected due to those unfavourable conditions. CtpF, the closest mycobacterial homologue to the eukaryotic ATPases, specifically the SERCA Ca2+-ATPase, is shown to respond to more stress conditions than any of the other ATPases, especially hypoxic conditions. In addition, the ctpF gene is part of the DosR regulon, involved in the adaptation of the bacteria to the anaerobic conditions inside the macrophage and its transition to the latency state. Using bioinformatic tools and in vitro assays, it has been possible to associate the ATPase activity of CtpF to calcium transport. Experimental evidence suggests that ATP hydrolysis is calcium-dependent and its role in calcium homeostasis has been indirectly observed as it provides cells with tolerance against this metal. However, the ionic specificity of this transporter has not been fully stablished yet because it has also shown to be stimulated by K+ and Na+. Consequently, the main goal of this work was to confirm the ion specificity of CtpF through metal accumulation assays on whole cells and membrane vesicles from M. smegmatis, enriched with CtpF expressed under the control of the Hsp60 heat-shock promoter of the mycobacterial shuttle vector pMV261. Pma1, the Mycobacterium smegmatis homologue of CtpF was included in these assays to compare its response and thus infer whether their functions are equivalent or not. The results show that M. smegmatis and M. smegmatis ΔPma1 recombinant cells expressing CtpF accumulate less calcium than the respective wild-type strain and mutant strain, suggesting that CtpF is involved in the Ca2+ efflux from the cytoplasmic side of the membrane. Na+ and Na+/K+ intoxication showed no preferential accumulation in the recombinant or wild-type cells, which supports this affirmation. Calcium accumulation in membrane vesicles is also in agreement with those results as CtpF-enriched, inside-out vesicles accumulate more calcium than their wild-type and mutant counterparts. This experimental evidence allows the association of CtpF with calcium homeostasis in the mycobacterial cell.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Soto-Ospina, Carlos Yesid
Información adicional:Magíster en Ciencias-Bioquímica. Línea de Investigación: Hospedero-Patógeno.
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, ATPasas tipo P2A, CtpF, Absorción atómica, Acumulación, P2A ATPases, CtpF, Atomic Absorption, Accumulation
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 54 Química y ciencias afines / Chemistry
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:72633
Enviado por : Cristian Rosales
Enviado el día :14 Junio 2019 14:56
Ultima modificación:14 Junio 2019 14:56
Ultima modificación:14 Junio 2019 14:56
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