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Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos especializados

Martínez Buitrago, Paola Andrea (2019) Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos especializados. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá.

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Resumen

Uno de los desafíos actuales en el estudio de productos naturales de microorganismos es el re-aislamiento frecuente de compuestos conocidos. De otro lado, es conocido que múltiples clústers de genes que pueden codificar para metabolitos permanecen silenciados en condiciones estándares de laboratorio. Con el fin inducir la expresión de estos genes, se han desarrollado varios métodos que incluyen el co-cultivo de microorganismos, cuyo uso se ha incrementado en los últimos años. En este contexto, esta tesis de maestría se propuso implementar metodologías de selección y estudio co-cultivos de microorganismos que condujeran a la identificación de compuestos inducidos por la interacción de los microorganismos seleccionados. Como primer paso se revisaron 100 artículos de co-cultivos, buscando identificar los criterios más usados para la selección de microorganismos. Se encontró que, en la mayoría de los reportes, los co-cultivos seleccionados provienen de un screening de múltiples parejas de un cepario o que los autores no reportan cómo se llevó a cabo el proceso de selección. En los demás reportes se pudieron identificar los siguientes seis criterios: conocimiento previo de los microorganismos, criterio ecológico o parejas formadas por microorganismos recuperados de la misma muestra biológica, Actinobacteria vs. bacteria con ácido micólico en su pared celular, bacteria del género Streptomyces sp. vs. bacteria del género Streptomyces sp., bacteria del género Streptomyces sp. vs. Proteobacteria, y enfrentamiento con patógenos. Algunos de estos criterios se emplearon para seleccionar 15 microorganismos a partir del cepario del grupo de investigación, que contiene más de 200 microorganismos. Este set de microorganismos estaba conformado por 14 bacterias y un hongo, para su inclusión se emplearon como criterios de selección al menos uno de los que se mencionan a continuación: conocimiento previo de su producción química y/o actividad biológica, bacteria con ácido micólico en su pared celular, microorganismos recuperados de la misma muestra, y bacteria perteneciente al género Streptomyces. Posteriormente, se evaluaron todas los posibles co-cultivos binarios (105) en medio líquido a una escala de 15mL. Los extractos orgánicos de estos cultivos fueron analizados por UHPLC-DAD-ELSD, y se seleccionaron 5 parejas que mostraban cambios inducidos por la interacción. Estas 5 parejas fueron cultivadas en una escala de 100mL, donde se encontró que en ninguna de las parejas se observaban los cambios detectados a una escala de 15mL. Sumado a esto, en ninguno de los 5 co-cultivos se garantizó la coexistencia de ambos microorganismos. Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió realizar un screening de interacciones en medio sólido, empleando 4 medios de cultivo (PDA, ISP2, ISP3, LB), y evaluando interacciones a distancia e interacciones por contacto. Las primeras permitían evaluar las interacciones debidas a compuestos difusibles; las segundas permitían evaluar interacciones debidas a contacto célula-célula. Se evaluaron cambios fenotípicos inducidos por el co-cultivo y se evaluaron los extractos orgánicos por HPLC-DAD. Las interacciones promisorias fueron analizadas por RMN (experimentos RMN 1H y COSY). A partir de estos resultados se identificaron 7 co-cultivos cuya expresión metabólica era diferente respecto a los monocultivos respectivos, es decir parejas promisorias para el estudio de su producción metabólica. Estas parejas corresponden a: Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, LB): Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, PDA); Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, PDA); Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-115 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, ISP3); y Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-210 (distancia, ISP3). Los espectros de RMN y los cromatogramas sugieren que en los 4 co-cultivos en medio ISP3, se induce la producción de compuestos iguales o similares pero en concentraciones diferentes. El co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto, y en medio LB, se analizó empleando LC-MS/MS y se construyeron redes moleculares que permitieron observar que el co-cultivo induce la producción de una familia molecular. La derreplicación de esta red sugiere la producción de compuestos tipo macrólido y péptido con actividad antibiótica. El estudio del cultivo en mayor volumen (380 cajas) fue seguido por RMN, y permitió evidenciar algunos cambios menores, pero no permitió el aislamiento de compuestos inducidos por el co-cultivo. A partir del extracto orgánico del co-cultivo se aislaron el ácido 5-(2-amino-3-hidroxi-1-(1H-indol-3-il)propil)-2-hidroxibenzoico (4.1) y el ácido antranílico (4.2.). Estos compuestos son producidos por Streptomyces sp. PNM-161a en monocultivo por lo que su producción no es exclusiva al co-cultivo. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67, y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto y en PDA, fue analizado por LC-MS/MS. El uso de análisis multivariado, y la construcción de redes moleculares integrado con derreplicación (a partir del GNPS y el Dictionary of Natural Products), permitieron observar que el co-cultivo incrementa la concentración de la leucinostatina A y leucinostatina B, e induce la producción de 4 leucinostatinas ya reportadas. Este co-cultivo constituye el primer reporte de un co-cultivo exitoso entre un hongo y una bacteria con ácido micólico. Los dos co-cultivos por contacto que fueron estudiados demostraron ser poco reproducibles. Es necesario el mejoramiento de las condiciones experimentales con el fin de mejorar la reproducibilidad de estos experimentos. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 a distancia, y en PDA, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri). A partir de su extracto orgánico se aislaron los alcaloides tipo withasomnina de nombres 5,6-dihidro-2-(sec-butil)-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.1) y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.2), siendo el primero por primera vez reportado en esta tesis. Estos compuestos son inducidos por el co-cultivo, y probablemente producidos por la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 teniendo en cuenta el gradiente de difusión de los mismos. Este tipo de compuestos son poco comunes en la literatura científica de productos naturales obtenidos de microorganismos. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1. a distancia, y en medio ISP3, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri) teniendo en cuenta que de las 4 interacciones promisorias observadas en medio ISP3, ésta era la que a juzgar por RMN producía mayor cantidad de el(los) compuestos inducidos por el co-cultivo. A partir del extracto orgánico del co-cultivo se aisló el compuesto alternariol (5.3), una micotoxina ampliamente estudiada por estar presente en cultivos de alimentos. Este compuesto es producido por el hongo tanto en esta interacción, como en sus interacciones con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-210. Los extractos orgánicos de la zona de la interacción para estos 4 co-cultivos fueron analizados por LC/MS-MS, y se construyeron redes moleculares. Según estos análisis el co-cultivo del hongo con la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115 es el más prometedor para su posterior evaluación en mayor volumen pues es el que genera una mayor cantidad de features asociadas exclusivamente a él. Esta tesis es el primer reporte, hasta donde llega nuestro conocimiento, de un estudio químico de co-cultivo de microorganismos como estrategia de inducción de productos naturales en Colombia., Abstract: One of the current challenges in the study of natural products from microorganisms is the frequent reisolation of known compounds. Multiple gene clusters that may encode metabolites remain silent under standard laboratory conditions. In order to induce the expression of these genes, several methods have been developed, including microorganism co-culture, its use has increased in recent years. In this way, this master’s thesis was seeking to implement methodologies of selection and study of co-cultures that lead to the identification of compounds due to interaction. As a first step, 100 co-culture articles were reviewed, in order to identify the most commonly used criteria for microorganism selection. It was found that in most of the reports, the selected co-cultures came from a screening of multiple couples of a collection of microorganisms, or the authors did not report how the selection process was carried out. In the other reports the following six criteria were identified: prior knowledge of microorganisms, ecological criteria or couples of microorganisms recovered from the same biological sample, Actinobacteria vs. mycolic acid containing bacteria, bacteria of the genus Streptomyces sp. vs. bacteria of the genus Streptomyces sp., bacteria of the genus Streptomyces sp. vs. Proteobacteria and use of pathogens. Some of these criteria were used to select 15 microorganisms from the collection of microorganisms of the research group. This set included 14 bacteria and a fungus, for their inclusion at least one of the following selection criteria were used: prior knowledge of its chemical production and/or biological activity, mycolic acid containing bacteria, microorganisms recovered from the same sample, and bacteria from genus Streptomyces. Subsequently, binary co-cultures (105) were evaluated in liquid media on a 15mL scale. Organic extracts from these cultures were analyzed by UHPLC-DAD-ELSD, and 5 couples that showed changes due interaction were selected. These 5 couples were cultured on 100mL scale, where it was found that none of the couples had the detected changes at 15ml scale. In addition, none of the five co-cultures guaranteed the coexistence of both microorganisms. Taking into account these results, an interactions screening in solid media was performed using 4 different culture media (PDA, ISP2, ISP3, LB), and two different methodologies: distance assays and contact assays. The former allowed to evaluate the interactions due to diffusible compounds; the latter allowed to evaluate interactions due to cell-cell contact. Phenotypic changes induced by co-culture were evaluated and organic extracts were analyzed by HPLC-DAD. Promising interactions were analyzed by NMR (NMR 1H and COSY experiments). From these results, 7 co-cultures were identified as promising because their metabolic production was different from their respective monocultures. These couples are: Streptomyces sp. PNM-161a and Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, LB), Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance, PDA), Purpureocillium sp. PNM-67 and Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, PDA), Purpureocillium sp. PNM-67 and Streptomyces sp. IBUN-5.1 (distance, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-115 (distance, ISP3), Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance, ISP3), and Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-210 (distance, ISP3). NMR spectra and HPLC chromatograms suggest that the four ISP3 co-cultures produce equal or similar induced compounds but in different concentrations. The co-culture between Streptomyces sp. PNM-161a and the mycolic acid containing bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, LB) was analyzed using LC-MS/MS. Molecular networks showed that co-culture induces the production of a molecular family. Dereplication of this network suggests the production of macrolide and peptide compounds with antibiotic activity. The study of this co-culture (in 380 Petri dishes) was followed by NMR, and allowed to show some minor changes, but did not allow the isolation of induced compounds by co-culture. 5-(2-amino-3-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)propyl)-2-hydroxybenzoic acid (4.1) and anthranilic acid (4.2.) were isolated from the organic extract of the co-culture. These compounds are produced by Streptomyces sp. PNM-161a in monoculture so their production is not exclusive to co-culture. The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and the mycolic acid containing bacteria Rhodococcus sp. RKHC-26 (contact, PDA) was analyzed by LC-MS/MS. Multivariate data analysis and the construction of molecular networks were integrated with dereplication (using GNPS and the Dictionary of Natural Products). This analysis showed that the co-culture increases the concentration of leucinostatin A and leucinostatin B and induces the production of 4 leucinostatins previously reported. To our knowledge, the co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and Rhodococcus sp. RKHC-26 is the first successful example of an interaction between a fungus and mycolic acid-containing bacteria. The two co-cultures whose interaction is due to cell-cell contact lack reproducibility. Improvement of experimental conditions is needed for the establishment of contact co-cultures in order to improve the reproducibility of experiments. The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and Paenibacillus sp. PNM-123 (distance, PDA) was cultured in 450 Petri dishes and from its organic extract withasomnine-type alkaloid compounds were isolated: 5,6-dihydro-2-(sec-butyl)-4H-pyrrolo[1,2b]pyzole (5.1) and 5,6-dihydro-2-isopropyl-4H-pyrrolo[1,2b]pyrazole (5.2). Compound 5.1. has not been reported previously. These compounds are induced by co-cultivation and are probably produced by Paenibacillus sp. PNM-123 taking into account their diffusion gradient. This kind of compounds is rare in the scientific literature of natural products obtained from microorganisms. The co-culture between Purpureocillium sp. PNM-67 and Streptomyces sp. IBUN-5.1. (distance, ISP3) was performed in 450 Petri dishes taking into account that of the 4 promising interactions observed in ISP3 medium, this couple was the one that produced the highest amount of the induced compounds according to NMR analysis. Alternariol (5.3) was isolated from the organic extract of the co-culture. This compound is produced by the fungus due interaction in this co-culture, and in co-cultures with Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 and Paenibacillus sp. PNM-210. Organic extracts from the interaction zones of these 4 co-cultures were analyzed by LC/MS-MS, and molecular networks were built. According to these analyses, the co-culture of the fungus with Paenibacillus sp. PNM-115 is the most promising for further chemical studies because it induces the greatest amount of features associated exclusively with its co-culture. As far as we know, this thesis is the first report in Colombia of a chemical study of microorganism co-culture as a strategy for natural products induction.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Castellanos Hernández, Leonardo
Información adicional:Magíster en Ciencias Química. Línea de Investigación: Productos Naturales.
Palabras clave:Co-cultivo, Fermentación mixta, Productos naturales, Microorganism co-culture, Mixed fermentation, Interspecies interaction, Mycolic acid-containing bacteria, Natural products
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 54 Química y ciencias afines / Chemistry
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 55 Ciencias de la tierra / Earth sciences & geology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 63 Agricultura y tecnologías relacionadas / Agriculture
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:74341
Enviado por : Paola Andrea Martínez Buitrago
Enviado el día :26 Septiembre 2019 15:59
Ultima modificación:26 Septiembre 2019 15:59
Ultima modificación:26 Septiembre 2019 15:59
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